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Production d'anticorps à façon


souris

 

 

LES DIFFERENTES ETAPES

Ce projet comprend plusieurs étapes clés nécessaires à la réalisation des anticorps monoclonaux. Depuis novembre 2016, notre laboratoire est certifié ISO 9001:2015. Cette certification démontre notre engagement à fournir à nos clients une prestation de qualité et à faire reconnaître nos compétences au niveau international.


ETAPE 1 : Immunisations et contrôle de la réponse immunitaire
Quatre souris BALB/c seront immunisées et le nombre d'injections dépendra de la réponse immunitaire des animaux (une saignée intermédiaire sera réalisée après la 4eme injection). Il est à noter que nous disposons d'un adjuvant permettant l'obtention d'une réponse immunitaire forte.


ETAPE 2 : Fusion cellulaire et production des hybridomes
La fusion cellulaire sera réalisée entre les splénocytes immuns et des myélomes de lignée Sp2/0-Ag 14 en utilisant du polyéthylène glycol.
La sélection des hybridomes sera réalisée en milieu sélectif HAT.


ETAPE 3 : Criblage des hybridomes
Pour réaliser le criblage des hybridomes par test ELISA, le laboratoire demandeur devra fournir suffisamment d'antigènes. Dix plaques ELISA seront utilisées. Pour un meilleur criblage, un test ELISA triple sandwich est recommandé. Pour cela, le laboratoire demandeur devra éventuellement fournir un anticorps polyclonal de lapin (ou autre) dirigé contre l'agent pathogène.


ETAPE 4 : Clonage et caractérisation
L'obtention des anticorps monoclonaux sera réalisée à partir des cultures d'hybridomes secrétant des anticorps spécifiques. Deux ou trois dilutions limites seront nécessaires pour s'assurer de la monoclonalité de la culture cellulaire. L'isotypage des anticorps monoclonaux sera également effectué.


ETAPE 5 : Production des anticorps monoclonaux
Les hybridomes spécifiques seront multipliés puis congelés dans l'azote liquide afin de préserver les lignées cellulaires.
Normalement, les anticorps monoclonaux seront produits par culture in vitro des hybridomes (récupération des surnageants de culture); concentration moyenne estimée d'anticorps : 5-20 µg/ml

L'entretien des hybridomes et la production d'anticorps en masse feront l'objet d'un contrat particulier, le cas échéant.


ETAPE 6 : Purification des anticorps & couplage enzymatique
Les anticorps monoclonaux de type IgG peuvent être purifiés sur colonne de chromatographie d'affinité en utilisant la protéine G. Les anticorps d'isotype différent (IgM par exemple) peuvent être purifiés en utilisant d'autres méthodes.
Selon les besoins du laboratoire demandeur, les anticorps monoclonaux purifiés pourront être couplés soit à la biotine, soit à la phosphatase alcaline, soit à la peroxydase. La réactivité des anticorps couplés sera testée en utilisant un test ELISA.


ETAPE 7 : Calibration du test ELISA
L'efficacité d'une méthode de détection dépend principalement de trois facteurs : la sensibilité de la technique, le degré de spécificité de la détection et des conditions d'utilisation en pratique. Ces trois facteurs sont pris en compte afin d'élaborer un test ELISA fiable adapté aux analyses de routine.


ETAPE 8 : Validation des réactifs
La mise au point d'un test ELISA de référence nécessite la validation de ces outils, éventuellement sur plusieurs souches d'antigènes d'origines différentes, provenant de plusieurs pays. Les réactifs retenus seront ceux qui présenteront le spectre de détection le plus étendu.

CALENDRIER ET DELAIS

- Le démarrage de la prestation pourra intervenir dans un délai d'une quinzaine de jours à compter de la signature du contrat.

- La durée globale de l'intervention est fixée entre 3 et 6 mois à compter de la réception de l'accord définitif.

- Le respect de ce calendrier dépend des contraintes indépendantes de notre volonté et, en particulier, celles qui sont liées au pouvoir immunogène de l'antigène.


CLAUSES DE CONFIDENTIALITE

Nous nous engageons à garder confidentielles toutes les informations relatives à nos clients si elles n'ont pas été explicitement reconnues comme non confidentielles.
SEDIAG et les membres de l'équipe impliqués dans ce projet sont soumis au secret professionnel et s'engagent à respecter les clauses de confidentialités liées à l'exécution de leur mission.

 

Pour tous renseignements complémentaires, merci de contacter :

Dr. Sam SEDDAS
Responsable Laboratoire de Culture Cellulaire


SEDIAG SAS
Technopole Agro-Environnement (AgrOnov)
Batiment B - 2eme etage
RD 31
21110 Breteniere - FRANCE

Tel : +33 (0) 3. 80 .67. 49. 42
email: sam.seddas@sediag.com

souris

The different steps

The production of monoclonal antibodies involves the following steps and this activity is ISO 9001:2015 certifyed.

STEP 1 : Immunization of animals and analysis of their immune response

Four BALB/c mice are immunized over several weeks and their immune response is analysed (intermediate bleeds will be performed after the 4th immunization). A special adjuvant is used to ensure a strong immune response in the injected animals.


STEP 2 : Cell fusion and production of hybridomas

Spleen cells of an immunized animal are fused with a Sp2/0-Ag 14 myeloma cell line, using polyethyleneglycol as fusion agent.
Hybridomas are selected using HAT selective medium.


STEP 3 : Screening of hybridomas

Hybridomas are screened by ELISA using suitable antigens. 10 ELISA plates will be used. For custom production of monoclonal antibodies, it is necessary to provide the Company with suitable antigenic material. A polyclonal antiserum directed against the antigen, produced in rabbits or other animals, may also be required.

STEP 4 : Cell cloning and characterization

Monoclonal antibodies are obtained from hybridoma cells culture. Subcloning of these cultures is necessary to insure the monoclonality of the cell culture.
Monoclonal antibody will be isotyped.

STEP 5 : Production of monoclonal antibodies

The specific hybridomas are grown by cell culture and the cell lines are stored in liquid nitrogen.
Normally, monoclonal antibody will be produced by in vitro cell culture (collection of cell culture supernatant) at an approximate concentration of 5-20 µg/ml.
Maintenance of hybridomas and production of large amounts of antibodies can be undertaken on request.


STEP 6 : Purification and enzymatic coupling of antibodies

Monoclonal antibodies (IgG class) can be purified by affinity chromatography using protein G column. Antibodies of other isotype (IgM) can be purified using other methods.
Purified antibodies can be linked to biotin, alkaline phosphatase or peroxidase. The reactivity of the labelled antibodies is tested by ELISA.


STEP 7 : Calibration of ELISA test

The quality of a detection method depends on three principal factors : sensitivity of the technique, specificity of detection, and experimental conditions for routine use. All three factors are taken into account.


STEP 8 : Validation of the reagents


Reagents need to be validated to develop reference ELISA tests. This can be done using different strains of the virus from different parts of the world. Reagents showing the largest detection spectrum will be selected.


PLANNING

An antibody production project can begin two weeks after the signature of the agreement.
The project will take between three to six months, depending on the immunogenic potential of the antigen.

CONFIDENTIALITY

All information exchanged between SEDIAG and its customers will remain confidential unless recognized as non confidential.
SEDIAG and all its employees implicated in any project will respect confidentiality clauses.

If you need any complementary information, do not hesitate to contact:

Dr. Sam SEDDAS
Cell Culture Lab Manager


SEDIAG SAS
Technopole Agro-Environnement (AgrOnov)
Batiment B - 2eme etage
RD 31
21110 Breteniere - FRANCE

Tel : +33 (0) 3. 80 .67. 49. 42
email: sam.seddas@sediag.com